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II.1 Le fonctionnement et les limites du microscope photonique

Le microscope photonique (ou optique) est le descendant des premiers microscopes inventés en Hollande au XVIIème siècle et qui, sans cesse développés au cours des siècles, ont contribué si puissamment à notre connaissance du monde microscopique, dans tous les domaines des sciences expérimentales de la physique à la chimie, de la pétrologie à la biologie. Il utilise les radiations électromagnétiques du spectre visible (la lumière) ou dans le proche infrarouge ou ultraviolet, dont la propagation est déviée, focalisée par des lentilles de verre. La lumière est une ondulation constituée par des vibrations de champs électrique et magnétique se propageant aussi bien dans le vide que dans l'air ou dans des matériaux transparents. Ces vibrations sont périodiques, c'est-à-dire qu'elles se retrouvent identiques à elles-mêmes en un point de l'espace à des intervalles de temps réguliers (la période T  exprimée en secondes) ou avec une fréquence n = 1/T (exprimée en Hertz). Elles se propagent dans le vide à la vitesse c (égale à la vitesse de la lumière) et la distance, à un instant donné, entre deux états équivalents de l'oscillation est la longueur d'onde l (exprimée en unités de longueur). Chaque couleur du spectre visible correspond à une longueur d'onde déterminée comprise entre 0,4 et 0,7 mm environ. La lumière blanche est un mélange de toutes les radiations de longueur d'onde comprises dans cette bande. L'ultraviolet correspond aux radiations de longueur d'onde inférieure et l'infrarouge à celles  de longueur d'onde supérieure.

Un microscope traditionnel est constitué des principaux éléments suivants:

  • une source de rayonnement lumineux et un dispositif d'éclairage de l'objet;
  • une optique constituée de plusieurs lentilles assurant la fonction d'agrandissement;
  • un détecteur permettant l'observation ou l'enregistrement de l'image (oeil, émulsion photographique, caméra et moniteur TV).

L'échantillon peut être observé en transmission s'il est partiellement transparent à la lumière ou en réflexion si il possède un fort pouvoir réfléchissant comme une surface métallique ou minérale. La figure II.1 présente un schéma de principe pour un microscope moderne permettant une variété d'éclairements et de modes d'observation. On y repère plusieurs familles de lentilles: les condenseurs, l'objectif, l'oculaire, les projecteurs. L'instrument original, à l'architecture simplifiée, était constitué d'un objectif qui donne de l'objet une image agrandie et d'un oculaire, jouant le rôle d'une loupe et au travers duquel on observe à l'infini une image virtuelle agrandie. L'objectif est en fait le coeur du microscope et de ses propriétés dépendent essentiellement les performances de l'instrument.

Figure II.1

Dans un schéma simplifié (voir la fig. II.2), pour un microscope plein champ où l'ensemble de la préparation est éclairé, on assimile l'objectif et l'oculaire à des lentilles minces simples. L'objet est représenté par un segment A0B0 dont l'objectif de distance focale f (de quelques mm) donne une image agrandie A1B1. De cette image située dans son plan focal objet (distance focale f' de quelques cm), l'oculaire donne une image A'B' rejetée à l'infini et observée par l'œil. La mise au point s'effectue en modifiant la distance frontale entre l'objet et la face d'entrée de l'objectif.

En microscopie visuelle, on appelle grossissement le rapport entre l'angle q' sous lequel on voit dans l'instrument l'image A'B' et l'angle q sous lequel l'œil le verrait à la distance d'approche maximum soit 25 cm:

$G=\frac{\tan \theta '}{\tan \theta}\simeq 500$

Pour obtenir une microphotographie, on introduit après l'oculaire un objectif photographique qui forme sur l'émulsion placée dans son plan focal une image réelle A''B''. Dans ce cas on caractérise le fonctionnement du microscope par son grandissement linéaire total:

$$ g=\frac{A''B''}{A_0B_0}$$

Figure II.2 La formation de l'image dans un microscope optique.

Même si on augmente le grossissement au-delà de 1000, la qualité de l'observation ne s'améliore pas car on atteint alors la limite de résolution de l'instrument. Cette notion mérite une discussion plus approfondie. Le premier obstacle est associé à la nature ondulatoire du rayonnement: il s'agit du phénomène de diffraction. L'image d'un point, donnée par une lentille parfaite et un rayonnement monochromatique de longueur d'onde l, est une tache circulaire brillante entourée d'anneaux moins lumineux dont l'intensité décroît lorsqu'on s'écarte du centre; il s'agit de la tache d'Airy dont on sait que le diamètre d est égal à 1.22 l/a' (voir fig. II.3).

Figure II.3 - Diffraction par une ouverture et définition du pouvoir de résolution

Ramenée au plan objet, cette dimension s'exprime grâce à la même formule avec l'angle a égal au demi-angle sous lequel l'objet est vu par l'objectif. A partir de la formule ci-dessus, on constate que cette tache sera d'autant plus étroite, et l'image par conséquent d'autant plus piquée, que l'angle a augmente et que la longueur d'onde l décroît. Pour une lentille objectif de faible distance focale travaillant avec un grandissement de l'ordre de 100, l'angle a n'est plus très petit et on le remplace dans la formule ci-dessus par l'ouverture numérique $O_n=n\sin \alpha$ où n est l'indice de réfraction du milieu dans lequel on peut immerger l'échantillon devant la face d'entrée de l'objectif. Les plus grandes ouvertures numériques sont de l'ordre de 1,3. Pour une longueur d'onde de 0,6 mm correspondant à de la lumière jaune, on obtient donc une valeur de d = 0,56 mm.

Le pouvoir de résolution (ou pouvoir séparateur) mesure la distance transversale minimale s entre deux points dont les taches de diffraction peuvent être séparées. Suivant le critère de lord Rayleigh, on définit cette distance pour le cas où le maximum d'une tache de diffraction se situe au premier zéro de la tache voisine. Il en résulte que:

$$s=\frac{0.61\lambda}{O_n}$$

soit 0,28 µm pour l'exemple ci-dessus.

Il existe une autre façon de mesurer la qualité de l'observation fournie par un système optique que l'on comprend aisément en se référant aux mires de réglage de nos écrans de télévision. Supposant que notre objet soit constitué d'un réseau de lignes blanches et noires de périodicité p. Comme le montre la fig. II.4, l'image qu'en donne l'objectif est un contraste oscillant g = (I2 - I1)/(I1 + I2) où I2 est l'intensité des maximums et I1 celle des minimums. La fréquence spatiale n'a pas changé mais les traits noirs sont devenus gris et cet effet est d'autant plus marqué que la distance p est plus faible, c'est-à-dire quand la taille de la tache de diffraction devient de l'ordre de grandeur de la période p. On représente cette variation sous forme d'une fonction de transfert de contraste entre la valeur du contraste g et la fréquence spatiale 1/p. Pour une certaine fréquence de coupure 1/p0, le contraste dans l'image est devenu zéro et I1 = I2. La connaissance de la fonction de transfert, et de la fréquence de coupure en particulier, apporte toutes les informations nécessaires sur la loi de correspondance entre l'objet et l'image.

Figure II.4 Une autre approche à la définition du pouvoir de résolution : la fonction de transfert.

Dans la discussion qui précède, nous avons supposé que la lentille objectif est une lentille parfaite. Or on sait que les lentilles de verre ne sont pas exemptes de défauts. Elles souffrent en particulier de chromatisme, c'est-à-dire qu'elles focalisent mieux les radiations de plus courte longueur d'onde, ce qui entraîne des effets d'irisation lors de l'utilisation de la lumière blanche. De plus, même pour une lumière monochromatique, la focalisation n'est pas parfaite. Par exemple, les rayons marginaux convergent davantage que les rayons passant près de l'axe de la lentille, ce qui est responsable d'effets connus sous le nom d'aberration sphérique (ou d'ouverture) et de coma. Les lentilles de l'optique photonique présentent cependant une grande qualité, à savoir qu'elles peuvent être soit convergentes, soit divergentes selon la nature de la courbure de leurs faces. En associant plusieurs lentilles de propriétés différentes en doublets, triplets et multiplets, il est possible de réaliser des objectifs stigmatiques, pour lesquels le chromatisme, l'aberration sphérique et la coma sont corrigés.

Suivant la direction de propagation du rayonnement en transmission, il est aussi important de définir une résolution verticale, ou profondeur de champ. C'est la distance dz, sur l'axe optique, pour laquelle la netteté des détails perçus reste acceptable. Cette épaisseur est d'autant plus faible que l'ouverture numérique On est plus grande. Dans les meilleurs cas elle est aussi de l'ordre d'une fraction de micromètre et de cette façon on peut dire que le microscope réalise une coupe optique dans l'objet, bien qu'un rayonnement lumineux défocalisé provenant des coupes adjacentes soit aussi transmis à l'observateur.

Afin d'améliorer le pouvoir de discrimination optique à travers l'épaisseur d'un échantillon transparent, le microscope confocal à balayage laser est apparu récemment sur le marché. Dans cet instrument, la source et le détecteur sont focalisés simultanément en un même point de l'échantillon par un jeu adapté de trous d'épingle (diaphragmes), de miroirs et d'objectifs communs. L'échantillon est éclairé et interrogé point par point, de façon successive grâce à un mécanisme de balayage optique du faisceau. Ce principe permet d'éliminer totalement la lumière qui ne provient pas du plan de mise au point optique. Par conséquent, on a ainsi accès à un contraste amélioré, une très faible profondeur de champ (de l'ordre de 0,5 mm) tout en conservant une résolution latérale de 0,2 à 0,3 mm par utilisation d'objectifs à immersion de forte ouverture numérique. Ce microscope confocal, permettant de réaliser des observations tridimensionnelles avec une résolution submicronique dans les trois directions, représente le développement le plus important de la microscopie photonique au cours des dix dernières années, en particulier dans le domaine tissulaire et cellulaire lorsqu'il est utilisé avec des marqueurs fluorescents spécifiques.

Dans cet exposé rapide des acquis de la microscopie photonique, nous avons volontairement omis les développements les plus récents en microscopie de champ proche, sans propagation, où la distance objet-détecteur est faible par rapport à la longueur d'onde du rayonnement. Il s'agit d'une des retombées les plus spectaculaires des techniques de microscopies tunnels déjà mentionnées brièvement en I.2.