Chapitre IV : Les échantillons pour la microscopie électronique

Vis à vis de la diversité des matériaux à observer, des observations recherchées, des outils utilisés, il est évident que la préparation des échantillons destinés à l'examen par microscopie électronique peut emprunter des voies très variées. Nous allons identifier dans un premier temps les contraintes générales avant de présenter une sélection de techniques utilisables selon qu'on s'intéresse à des substances organiques ou inorganiques.

IV-1 - Contraintes générales.

Quel que soit le type de microscope utilisé, l'observation se déroule sous vide et sous l'impact d'un faisceau d'électrons. Il en résulte une double contrainte :

i) la morphologie et la structure doivent être préservées afin que l'examen apporte des informations significatives;

ii) l'échantillon ne doit pas subir une évolution irréversible sous l'action du faisceau primaire, ce qui signifie en particulier absence d'effets de charge électrique sur les surfaces ou réduction des dégâts d'irradiation dans le matériau lui-même.

Enfin, selon la catégorie d'instruments, on s'intéresse soit à la surface d'échantillons massifs (dans les microscopes à balayage en réflexion), soit à des lames minces (dans les microscopes à transmission). La zone génératrice de l'information dépend à la fois des paramètres du faisceau primaire (tension d'accélération, dimensions latérales...) et des mécanismes d'interaction entre les électrons et le matériau étudié, sur lesquels nous reviendrons de façon détaillée au cours du prochain chapitre.

A ce niveau, il est seulement nécessaire de rappeler que dans une géométrie par réflexion, les électrons transportant le signal utile sont issus d'une épaisseur superficielle variant du nanomètre (pour les électrons secondaires) à quelques centaines ou milliers de nanomètres (pour les électrons rétrodiffusés). Au contraire dans la géométrie à transmission qui est particulièrement adaptée à l'étude à très haute résolution des propriétés internes du solide, les échantillons doivent être suffisamment minces pour que les électrons transmis y subissent un nombre réduit d'interactions. Et que, par conséquent, le faisceau transmis conserve un degré satisfaisant de collimation et une dispersion énergétique réduite afin de produire sur l'écran ou le détecteur une image finale de bonne qualité. Il n'existe pas de critère simple de définition d'une épaisseur critique, celle-ci dépendant de l'information et de la résolution recherchée. En général, on admet que cette épaisseur est de l'ordre de quelques dizaines à quelques centaines de nanomètres pour des électrons d'énergie primaire 100 ou 200 keV. Pour des électrons de plus haute énergie, la pénétration est accrue et on peut obtenir des images nettes avec des échantillons d'épaisseur micrométrique. Ceci a constitué un des grands succès des microscopes fonctionnant sous des tensions de 1,2 et 3 MV, construits à Toulouse sous l'impulsion de G. Dupouy.

En résumé, l'observation par MEB requiert une surface propre, dont la morphologie a été préservée au cours de la préparation et peu sensible aux effets de charge. A l'opposé, le TEM nécessite des échantillons préparés sous forme de lames minces, résistantes aux électrons et orientées de telle sorte que l'information acquise soit adaptée à la géométrie du problème recherché.

En outre le très grand pouvoir de grandissement offert par l’instrument impose une réflexion nouvelle lorsqu’on entreprend de relier une observation réalisée à l’échelle du microscope électronique à la dimension réelle de la matière à étudier. Prenons l’exemple du microscope à transmission. Supposons qu'en moyenne une image 10 cm x 10 cm corresponde à l'observation d'un échantillon d'épaisseur 50 nm, avec un grandissement de 100 000. Il lui correspond un volume total de matière observé de :

            V = 50 x 103 x 103 = 5 x 107 nm3

contenant environ 5 x 109 atomes.

Pour comparaison, un mm3 de matière contient de l'ordre de 1020 atomes. Il faudrait donc plus de 1010 images de ce type pour explorer systématiquement l'ensemble d'un millimètre cube de matériau. Ceci est absolument hors de portée : un expérimentateur entraîné réalise de 50 à 100 bonnes images en une journée !!... Et en outre il est sûrement sans intérêt de vouloir effectuer ce type d'examen exhaustif. Au passage on peut aussi se dire qu'avec tous les microscopes électroniques ayant existé depuis leur invention, on n'a pas encore exploré un volume de matériau de l'ordre du millimètre cube.

Par conséquent, on conçoit l'importance de l'échantillonnage, c'est-à-dire de cette démarche qui consiste à localiser et à identifier rapidement au cours d'un examen au microscope électronique les zones représentatives des propriétés étudiées. On est largement aidé dans cette tâche par la grande souplesse du microscope à "zoomer" sur des zones choisies de l'échantillon, c'est-à-dire de travailler d'abord sous un grandissement d'une valeur de quelques dizaines à quelques centaines pour un examen général et une définition des zones minces intéressantes, avant de l'augmenter jusqu'à des valeurs de l'ordre de plusieurs centaines de mille pour l'observation fine à haute résolution.

IV-2 -Les techniques de préparation d'échantillons inorganiques pour la microscopie en transmission

Pour obtenir des lames minces adaptées à l'observation en microscopie à transmission, de nombreuses solutions ont été proposées et utilisées. Elles dépendent essentiellement de la nature chimique de l'échantillon massif et du caractère  plus ou moins localisé de l'information recherchée. Mais il faut particulièrement insister sur le fait que la réussite de la préparation d'un bon échantillon est souvent le garant d'une observation riche en renseignements nouveaux. On ne saurait donc sous-estimer cet aspect du travail du microscopiste, qui représente bien souvent une partie bien plus importante de son temps que l'examen à proprement parler au microscope.

En règle générale, il existe deux grandes voies pour réaliser un échantillon mince :

  • partir d'un échantillon massif et l'amincir, de préférence dans la zone la plus utile ;
  • faire croître lentement l'échantillon à observer sur un substrat avant de l'en décoller et de le déposer sur une grille support.

Dans un certain nombre de situations privilégiées, il suffit de broyer, de gratter le matériau à examiner, de le dissoudre dans un liquide adapté dont on prélève une goutte à sécher sur un support ultra-mince adapté. Ce support universel est une grille de cuivre recouverte d'un film très mince de carbone amorphe percé de trous sur les bords desquels grâce à l'intensité des forces de tension superficielle, de nombreux échantillons restent attachés de façon stable tout en débordant sur le vide. Ces lames de carbone à trous, que l'on trouve maintenant aisément dans le commerce, sont fabriquées par  évaporation Joule d'un barreau de graphite sous vide et condensation des vapeurs carbonées sur substrat de NaCl par exemple, dont il est ensuite décollé par flottage sur la surface d'un liquide.

De façon générale, il existe maintenant tout un ensemble de techniques de dépôt et croissance contrôlés de matériaux divers sur un support donné. Le matériau est évaporé par effet Joule ou sous bombardement électronique à partir d'un matériau massif et déposé graduellement sur un substrat déterminé. Un essor tout particulier de ces méthodes a été stimulé par l'industrie des semiconducteurs où les procédés de dépôt épitaxique en jet moléculaire ont été largement développés pour la réalisation de systèmes complexes dans lesquels la composition chimique du matériau peut varier continûment, couche atomique par couche atomique, au cours de la croissance.

Mais dans la grande majorité des cas, l'accès à des vastes plages d'échantillons minces, c'est-à-dire d'épaisseur inférieure à 100 nm sur plusieurs microns de large, requiert l'utilisation de techniques diverses d'amincissement contrôlé. Il est généralement nécessaire de prélever l'échantillon à amincir (un disque mince de 3 mm de diamètre) et de le préamincir avec diverses techniques grossières utilisant des procédés mécaniques ou chimiques. Les derniers stades de l'amincissement doivent être contrôlés de façon plus précise afin de préserver de vastes zones très minces au voisinage du trou ainsi réalisé (voir fig. IV.1).                                                        

Figure IV.1 Les étapes de l'amincissement d'un échantillon inorganique pour l'observation en microscopie à transmission de zones d'intérêt situées près du bord d'un trou.

Parmi les techniques utilisées :

  • Le polissage électrolytique (méthode de l'anode soluble) est bien adaptée aux métaux et alliages.
  • Le polissage chimique (dissolution progressive sous l'impact d'un produit dissolvant, acide par exemple) utilisé pour les semiconducteurs.
  • L'amincissement sous bombardement d'ions primaires qui érode progressivement l'échantillon. C'est devenu au cours des dernières années une technique très populaire dans la mesure où elle peut être utilisée pour presque tous les types de matériau. En outre, il est possible de réaliser des faisceaux d'ions focalisés et de les adapter à des usinages à façon pour un amincissement localisé. La figure IV.2 présente le principe d'un amincisseur équipé de ses deux canons à ions, ainsi qu'un exemple de lame mince de dispositif semiconducteur réalisée sous bombardement ionique focalisé.En  particulier, cette technique est très adaptée à la préparation de sections transverses, c'est-à-dire à la réalisation d'échantillons dans lesquels l'interface ou les interfaces à étudier sont orientés parallèlement au faisceau d'électrons du microscope, et sont visibles dans des zones minces près du bord de l'échantillon (c'est-à-dire obéissant de façon aussi satisfaisante que possible aux conditions représentées en loupe sur la figure IV.1).

                                

Figure IV.2 (a et b) Schéma de principe d'un appareil d'amincissement par bombardement ionique (Duomill-Gatan)

    

  • Enfin, le dernier cri de la technique d'amincissement est le polissage mécanique très doux sur un système dit tripode. Mais il faut être un artiste pour réaliser cet amincissement très graduel, avec des angles de biseau très faibles en bordure de la lame mince.

IV-3 - Les techniques de préparation des échantillons organiques

Que ce soit pour l'observation en transmission ou en réflexion, la matière organique présente des spécificités liées à son caractère très déformable. On imagine aisément les dégâts qui peuvent se produire lorsqu'on introduit un échantillon de tissu biologique, qui contient une très grande proportion d'eau, dans l'environnement sous vide que constitue la chambre d'observation de tout microscope électronique. Les espoirs de voir des cellules vivantes se sont donc évanouis depuis longtemps, confirmant ainsi les sombres prédictions de Gabor, avant même d'invoquer le rôle destructeur du faisceau d'électrons. Cependant la situation n'est pas complètement désespérée, et au prix d'astuces nombreuses et diversifiées, les biologistes ont pu au cours des décennies récentes, "voir" l'ultrastructure des tissus et des cellules, et à un degré plus élaboré, étudier la morphologie de molécules individuelles comme les protéines et les acides nucléiques. Comment ces succès ont-ils pu être obtenus? En premier lieu grâce à l'ingéniosité des chercheurs qui ont su mettre au point toute une chaîne de traitements permettant la préservation de l'échantillon à partir de son prélèvement sur le sujet de l'étude, qui est bien souvent la souris de laboratoire, les cellules en culture in vitro, mais qui peut être aussi le patient humain, jusqu'à son observation sous le faisceau d'électrons du microscope.

Afin de maintenir l'échantillon dans un état morphologique aussi proche que possible de son état naturel, il est nécessaire d'effectuer un traitement de fixation, préalable à l'étape de déshydratation. Il s'agit, par un processus chimique ou physique approprié, d'éviter aux substances protéiniques ou lipidiques qui le composent, les déformations brutales qui accompagnent la mise sous vide. Dans la méthode "conventionnelle" de préparation d'échantillons pour l'observation en microscopie électronique, cette étape de fixation est réalisée chimiquement (fixation au glutaraldéhyde, puis au tétroxyde d'osmium le plus souvent) suivie de la déshydratation par substitution à la température ambiante de solvants organiques (alcool ou acétone) à l'eau, et de l'imprégnation dans différents types de résines, choisies en fonction de ce que l'on cherche à voir dans l'objet inclus. Après polymérisation, le matériau est devenu suffisamment résistant pour pouvoir éventuellement être débité sous forme de lames minces par découpe sous ultramicrotome. Cet instrument obéit au principe de la machine à découper le jambon. Mais l'arête qui cisaille l'échantillon est généralement en diamant afin de réaliser des sections d'épaisseur relativement homogène, de l'ordre de la centaine de nanomètres, pour l'observation en transmission. Enfin pour améliorer le contraste entre les différents organites cellulaires, on expose l'échantillon à un produit contenant des atomes lourds (classiquement acétate d'uranyl et citrate de plomb) afin que ces derniers en diffusant à la surface des différentes structures cellulaires, noyau, appareil de Golgi, mitochondries, les rendent visibles (voir plus loin la fig. V.4).

Récemment, les processus de fixation purement physiques, par congélation ultrarapide des tissus  sur un bloc de cuivre refroidi à l'hélium ou à l'azote liquide se sont imposés comme voie privilégiée pour la préservation des structures cellulaires et sub-cellulaires. Une fois la matière biologique congelée, de nombreuses voies de traitement ont été proposées conduisant à des observations très diverses. Elles sont regroupées sommairement dans le tableau IV.1.

Tableau IV.1

Pour les fragments de tissu, les suspensions ou cultures cellulaires, le produit cryofixé peut être sectionné par cryo-ultramicrotomie pour la réalisation de couches minces qui sont directement observées à l'état congelé hydraté dans un microscope équipé d'un porte-objet permettant l'observation à la température de l'azote liquide (77 K). Pour préserver l'aspect ultrastructural d'un tissu, il faut que l'eau soit congelée à l'état de glace amorphe et sa recristallisation en glace hexagonale ou cubique, plus stable, mais impropre à l'observation, doit être évitée en maintenant l'échantillon à une température inférieure au seuil de dévitrification, soit 153 K, tout au long de la chaîne du froid. Une seconde solution consiste à fracturer l'échantillon congelé sous vide afin d'en observer la surface de fracture directement à l'aide d'un microscope à balayage ou indirectement après dépôt d'une replique de carbone ultra-mince dont on observe le relief, éventuellement ombré à l'aide d'une évaporation de grains métalliques très fins pour en faciliter la visualisation, en microscopie à transmission conventionnelle à température ordinaire (il s'agit alors de la technique dite de cryodécapage). Enfin une dernière méthode utilise la déshydratation à froid sous vide suivie de traitements variés de cryo-substitution ou de cryo-imprégnation conduisant à la préparation d'échantillons secs pour une observation à la température ambiante comme avec une préparation chimique conventionnelle. Ces méthodes cryogéniques présentent des avantages nombreux vis à vis des techniques chimiques comme une préservation des structures jusqu'à une échelle de 2 à 3 nm et une stabilité de la composition chimique en limitant au maximum la redistribution des électrolytes inorganiques et constituants diffusibles. On peut aussi imaginer facilement son utilisation dans l'étude de la dynamique de comportements biologiques. En effet, il est possible de réaliser la trempe ultra-rapide de l'échantillon à tout instant d'un cycle d'activité physiologique afin de saisir une image de la structure, voire de la chimie locale, caractéristique de cet état d'activité.

Une autre grande catégorie d'études en microscopie électronique concerne les macromolécules ou ensembles macromoléculaires extraits de cellules ou de tissus. On sait en effet fragmenter un ensemble intégré de fonctions afin d'isoler une activité biologique particulière pour la caractériser. La plupart des fonctions biologiques sont associées à de grands assemblages macromoléculaires comportant des acides nucléiques (ADN ou ARN) associés à de nombreuses protéines et peptides. La compréhension des mécanismes d'action de ces complexes passe par l'étude des modifications  conformationnelles ou topologiques, le plus souvent induites par des interactions directes acides nucléiques-protéines. Pour les étudier, de nombreux procédés sont utilisés pour l'isolement et la visualisation des molécules isolées ou des complexes macromoléculaires. La plus efficace et la plus simple consiste à adsorber les molécules sur un support dont on sait contrôler l'état hydrophile ou hydrophobe de la surface par des traitements appropriés. Il est en effet important que la molécule biologique adhère sur la surface sans être déformée. Pour augmenter artificiellement la visibilité d'un objet de faible contraste déposé sur un support mince de carbone, on utilise des atomes lourds ainsi qu'illustré sur la figure IV. 3. Ils peuvent constituer soit un simple agent colorant le pourtour de l'objet (coloration positive), soit une matrice à l'intérieur de laquelle l'échantillon apparaît en contraste négatif (coloration négative). La figure IV. 4 constitue un exemple caractéristique de la façon dont on peut visualiser ainsi des molécules d'ADN déposées sur un film mince de carbone.

Figure IV. 3 Différentes méthodes de préparation d'échantillons de macromolécules isolées pour l'observation en microscopie électronique à transmission

Figure IV. 4 Images de molécules d'ADN circulaire. L'ADN extrait chimiquement et purifié, est déposé sur une peau de carbone très fine (environ 3,5 nm d'épaisseur) et contrasté par le dépôt de sel d'uranium qui se fixent sur les charges négatives de l'ADN. Un fort contraste est obtenu par l'observation des molécules en fond noir annulaire.a) double chaîne super torsadée avec chevauchement de brins; b) double chaîne circulaire relâchée, la coupure d'un des brins entraînant la libération des contraintes de superhélicité (clichés E.Delain, IGR Villejuif).

En utilisant des supports fonctionnalisés (films lipidiques), les molécules à étudier peuvent s'orienter, s'organiser et cristalliser en un réseau bidimensionnel. C'est sur de tels réseaux de protéines membranaires qu'ont pu être réalisées récemment par cristallographie électronique, des cartes structurales avec une résolution meilleure que 0,5 nm. Il s'agit là d'un développement très prometteur de la microscopie électronique, qui peut devenir compétitive avec les techniques de diffraction X pour résoudre des structures au niveau quasi-atomique, quand il est difficile de cristalliser des grandes quantités de matériau. Mais la préparation de l'échantillon ne constitue que la première étape d'une étude longue et délicate, où toutes les ressources les plus pointues de la microscopie elle-même (observation sous dose très réduite pour limiter les dommages d'irradiation) et du traitement de l'information a posteriori, sont requises.

Enfin, la méthode la plus élégante pour l'étude de dispersions de molécules individuelles consiste à congeler rapidement une suspension de ces molécules en milieux aqueux, en en plongeant une goutte adhérente à une grille de cuivre dans de l'éthane liquide. L'amincissement à une épaisseur convenable, est préalablement réalisé en éliminant une grande partie de la goutte avec un papier filtre. L'épaisseur du film de glace fin, de l'ordre de 100 nm permet l'observation des molécules maintenues dans leur solution d'origine, dans leur environnement aqueux et ionique initial. Cependant, les phénomènes de surface, gênants dans la technique du dépôt, ne sont pas complétement éliminés dans la mesure où l'échantillon est confiné dans une mince couche de solution. En outre l'orientation aléatoire des particules biologiques peut être un handicap, mais les progrès récents en analyse d'images permet de résoudre bien des difficultés quand on a accès à des populations de molécules de plusieurs milliers.

IV-4 - Les microscopes à environnement contrôlé

Pour clore ce chapitre, il est utile de mentionner quelques développements récents dans le domaine de la microscopie à balayage conventionnelle. L'environnement requis en vide et les phénomènes de charge induite par le faisceau primaire quand l'échantillon est non conducteur, en limitent singulièrement le champ d'applications, dans le monde industriel en particulier. Pour y remédier plusieurs solutions ont été utilisées. Par exemple, il est commun de recouvrir toute surface non conductrice d'un film mince métallique avant observation. Parmi les autres remèdes proposés, le recours à des tensions d'accélération réduites (de l'ordre du kV) permet de compenser à peu près exactement les charges apportées par le faisceau primaire et celles réémises par l'échantillon de telle sorte que la charge accumulée reste négligeable. Mais il est un développement récent qui semble apporter un remède à toutes ces difficultés.

Revenons sur la notion de vide. La pression atmosphérique normale se situe aux environs de 760 mm de mercure (dans les systèmes de pompage on aime bien encore l'unité "torr" qui équivaut à 1 mm de Hg): la pression de l'atmosphère équilibre le poids d'une colonne de mercure de 760 mm de haut. Les physiciens utilisent de nos jours l'unité Pascal (Pa), la pression normale de l'air est 105Pa. La pression résiduelle dans une colonne de microscope est de l'ordre de 10-4 Pa. Sous une telle pression le nombre de molécules de gaz par litre est de quelques 1013, si bien que la probabilité de collision entre un électron rapide du faisceau et une de ces molécules de gaz est pratiquement nulle. C'est la raison pour laquelle une telle qualité de vide est maintenue dans une colonne de microscope. Mais il n'est pas nécessaire qu'elle soit présente autour de l'échantillon lui-même. C'est ce qui a conduit au développement récent de microscopes avec un vide différentiel entre le microscope et la chambre échantillon. En maintenant dans cette dernière enceinte une moins bonne qualité de vide que dans le reste de la colonne (jusqu'à 50 torr dans le dernier microscope environnemental de la marque Electroscan), on conjugue plusieurs avantages. Le premier est une réduction des effets de charge électrique sur la surface d'un isolant. En effet les molécules de gaz autour de l'échantillon peuvent être ionisées sous l'impact soit des électrons primaires, soit des électrons secondaires, et venir neutraliser la surface du spécimen. Le second est de disposer d'une possibilité accrue de maintien des morphologies naturelles pour un grand nombre d'échantillons ayant tendance à dégazer facilement sous vide (papiers, lubrifiants, crèmes variées, nourriture..). Il en résulte un élargissement tout à fait spectaculaire du champ d'utilisation du microscope. Pour ne citer qu'un exemple aperçu lors d'un congrès récent de microscopie électronique, je mentionnerai la séquence tout à fait impressionnante des insectes se déplaçant dans des cavernes gigantesques à l'intérieur d'un fromage, insectes conservant tout leur dynamisme jusqu'à ce qu'un accroissement de la dose d'électrons nécessaire pour travailler à plus haute résolution, ne soit responsable de leur trépas. Il est donc possible dans ces conditions, c'est à dire avec des grandissements modestes, de suivre le mouvement d'organismes vivants à l'intérieur du microscope, contredisant ainsi une nouvelle fois les prédictions de Gabor.