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IV-3 - Les techniques de préparation des échantillons organiques

Que ce soit pour l'observation en transmission ou en réflexion, la matière organique présente des spécificités liées à son caractère très déformable. On imagine aisément les dégâts qui peuvent se produire lorsqu'on introduit un échantillon de tissu biologique, qui contient une très grande proportion d'eau, dans l'environnement sous vide que constitue la chambre d'observation de tout microscope électronique. Les espoirs de voir des cellules vivantes se sont donc évanouis depuis longtemps, confirmant ainsi les sombres prédictions de Gabor, avant même d'invoquer le rôle destructeur du faisceau d'électrons. Cependant la situation n'est pas complètement désespérée, et au prix d'astuces nombreuses et diversifiées, les biologistes ont pu au cours des décennies récentes, "voir" l'ultrastructure des tissus et des cellules, et à un degré plus élaboré, étudier la morphologie de molécules individuelles comme les protéines et les acides nucléiques. Comment ces succès ont-ils pu être obtenus? En premier lieu grâce à l'ingéniosité des chercheurs qui ont su mettre au point toute une chaîne de traitements permettant la préservation de l'échantillon à partir de son prélèvement sur le sujet de l'étude, qui est bien souvent la souris de laboratoire, les cellules en culture in vitro, mais qui peut être aussi le patient humain, jusqu'à son observation sous le faisceau d'électrons du microscope.

Afin de maintenir l'échantillon dans un état morphologique aussi proche que possible de son état naturel, il est nécessaire d'effectuer un traitement de fixation, préalable à l'étape de déshydratation. Il s'agit, par un processus chimique ou physique approprié, d'éviter aux substances protéiniques ou lipidiques qui le composent, les déformations brutales qui accompagnent la mise sous vide. Dans la méthode "conventionnelle" de préparation d'échantillons pour l'observation en microscopie électronique, cette étape de fixation est réalisée chimiquement (fixation au glutaraldéhyde, puis au tétroxyde d'osmium le plus souvent) suivie de la déshydratation par substitution à la température ambiante de solvants organiques (alcool ou acétone) à l'eau, et de l'imprégnation dans différents types de résines, choisies en fonction de ce que l'on cherche à voir dans l'objet inclus. Après polymérisation, le matériau est devenu suffisamment résistant pour pouvoir éventuellement être débité sous forme de lames minces par découpe sous ultramicrotome. Cet instrument obéit au principe de la machine à découper le jambon. Mais l'arête qui cisaille l'échantillon est généralement en diamant afin de réaliser des sections d'épaisseur relativement homogène, de l'ordre de la centaine de nanomètres, pour l'observation en transmission. Enfin pour améliorer le contraste entre les différents organites cellulaires, on expose l'échantillon à un produit contenant des atomes lourds (classiquement acétate d'uranyl et citrate de plomb) afin que ces derniers en diffusant à la surface des différentes structures cellulaires, noyau, appareil de Golgi, mitochondries, les rendent visibles (voir plus loin la fig. V.4).

Récemment, les processus de fixation purement physiques, par congélation ultrarapide des tissus  sur un bloc de cuivre refroidi à l'hélium ou à l'azote liquide se sont imposés comme voie privilégiée pour la préservation des structures cellulaires et sub-cellulaires. Une fois la matière biologique congelée, de nombreuses voies de traitement ont été proposées conduisant à des observations très diverses. Elles sont regroupées sommairement dans le tableau IV.1.

Tableau IV.1

Pour les fragments de tissu, les suspensions ou cultures cellulaires, le produit cryofixé peut être sectionné par cryo-ultramicrotomie pour la réalisation de couches minces qui sont directement observées à l'état congelé hydraté dans un microscope équipé d'un porte-objet permettant l'observation à la température de l'azote liquide (77 K). Pour préserver l'aspect ultrastructural d'un tissu, il faut que l'eau soit congelée à l'état de glace amorphe et sa recristallisation en glace hexagonale ou cubique, plus stable, mais impropre à l'observation, doit être évitée en maintenant l'échantillon à une température inférieure au seuil de dévitrification, soit 153 K, tout au long de la chaîne du froid. Une seconde solution consiste à fracturer l'échantillon congelé sous vide afin d'en observer la surface de fracture directement à l'aide d'un microscope à balayage ou indirectement après dépôt d'une replique de carbone ultra-mince dont on observe le relief, éventuellement ombré à l'aide d'une évaporation de grains métalliques très fins pour en faciliter la visualisation, en microscopie à transmission conventionnelle à température ordinaire (il s'agit alors de la technique dite de cryodécapage). Enfin une dernière méthode utilise la déshydratation à froid sous vide suivie de traitements variés de cryo-substitution ou de cryo-imprégnation conduisant à la préparation d'échantillons secs pour une observation à la température ambiante comme avec une préparation chimique conventionnelle. Ces méthodes cryogéniques présentent des avantages nombreux vis à vis des techniques chimiques comme une préservation des structures jusqu'à une échelle de 2 à 3 nm et une stabilité de la composition chimique en limitant au maximum la redistribution des électrolytes inorganiques et constituants diffusibles. On peut aussi imaginer facilement son utilisation dans l'étude de la dynamique de comportements biologiques. En effet, il est possible de réaliser la trempe ultra-rapide de l'échantillon à tout instant d'un cycle d'activité physiologique afin de saisir une image de la structure, voire de la chimie locale, caractéristique de cet état d'activité.

Une autre grande catégorie d'études en microscopie électronique concerne les macromolécules ou ensembles macromoléculaires extraits de cellules ou de tissus. On sait en effet fragmenter un ensemble intégré de fonctions afin d'isoler une activité biologique particulière pour la caractériser. La plupart des fonctions biologiques sont associées à de grands assemblages macromoléculaires comportant des acides nucléiques (ADN ou ARN) associés à de nombreuses protéines et peptides. La compréhension des mécanismes d'action de ces complexes passe par l'étude des modifications  conformationnelles ou topologiques, le plus souvent induites par des interactions directes acides nucléiques-protéines. Pour les étudier, de nombreux procédés sont utilisés pour l'isolement et la visualisation des molécules isolées ou des complexes macromoléculaires. La plus efficace et la plus simple consiste à adsorber les molécules sur un support dont on sait contrôler l'état hydrophile ou hydrophobe de la surface par des traitements appropriés. Il est en effet important que la molécule biologique adhère sur la surface sans être déformée. Pour augmenter artificiellement la visibilité d'un objet de faible contraste déposé sur un support mince de carbone, on utilise des atomes lourds ainsi qu'illustré sur la figure IV. 3. Ils peuvent constituer soit un simple agent colorant le pourtour de l'objet (coloration positive), soit une matrice à l'intérieur de laquelle l'échantillon apparaît en contraste négatif (coloration négative). La figure IV. 4 constitue un exemple caractéristique de la façon dont on peut visualiser ainsi des molécules d'ADN déposées sur un film mince de carbone.

Figure IV. 3 Différentes méthodes de préparation d'échantillons de macromolécules isolées pour l'observation en microscopie électronique à transmission

Figure IV. 4 Images de molécules d'ADN circulaire. L'ADN extrait chimiquement et purifié, est déposé sur une peau de carbone très fine (environ 3,5 nm d'épaisseur) et contrasté par le dépôt de sel d'uranium qui se fixent sur les charges négatives de l'ADN. Un fort contraste est obtenu par l'observation des molécules en fond noir annulaire.a) double chaîne super torsadée avec chevauchement de brins; b) double chaîne circulaire relâchée, la coupure d'un des brins entraînant la libération des contraintes de superhélicité (clichés E.Delain, IGR Villejuif).

En utilisant des supports fonctionnalisés (films lipidiques), les molécules à étudier peuvent s'orienter, s'organiser et cristalliser en un réseau bidimensionnel. C'est sur de tels réseaux de protéines membranaires qu'ont pu être réalisées récemment par cristallographie électronique, des cartes structurales avec une résolution meilleure que 0,5 nm. Il s'agit là d'un développement très prometteur de la microscopie électronique, qui peut devenir compétitive avec les techniques de diffraction X pour résoudre des structures au niveau quasi-atomique, quand il est difficile de cristalliser des grandes quantités de matériau. Mais la préparation de l'échantillon ne constitue que la première étape d'une étude longue et délicate, où toutes les ressources les plus pointues de la microscopie elle-même (observation sous dose très réduite pour limiter les dommages d'irradiation) et du traitement de l'information a posteriori, sont requises.

Enfin, la méthode la plus élégante pour l'étude de dispersions de molécules individuelles consiste à congeler rapidement une suspension de ces molécules en milieux aqueux, en en plongeant une goutte adhérente à une grille de cuivre dans de l'éthane liquide. L'amincissement à une épaisseur convenable, est préalablement réalisé en éliminant une grande partie de la goutte avec un papier filtre. L'épaisseur du film de glace fin, de l'ordre de 100 nm permet l'observation des molécules maintenues dans leur solution d'origine, dans leur environnement aqueux et ionique initial. Cependant, les phénomènes de surface, gênants dans la technique du dépôt, ne sont pas complétement éliminés dans la mesure où l'échantillon est confiné dans une mince couche de solution. En outre l'orientation aléatoire des particules biologiques peut être un handicap, mais les progrès récents en analyse d'images permet de résoudre bien des difficultés quand on a accès à des populations de molécules de plusieurs milliers.