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V.2. Interprétation du contraste dans des images de microscopie électronique à transmission.

La notion de contraste est tout à fait essentielle. Elle est directement incluse dans le fait qu'une image est une représentation bidimensionnelle d'une certaine propriété de l'échantillon (fig. I.5). Par conséquent, le nombre d'électrons recueillis en un point du détecteur $I(x,y)$ est différent de celui recueilli en un point voisin $I(x + \Delta x, y + \Delta y)$. Le contraste est défini comme la variation entre ces deux mesures réalisées en des points de l'échantillon séparés de $\Delta x/M$ et $\Delta y/M$ (avec M le grandissement du microscope) :

$$ C=\frac{I(x + \Delta x, y + \Delta y)-I(x,y)}{\overline{I(x,y)}} $$

où $\overline{I(x,y)}$ est la valeur moyenne de l'intensité dans la zone considérée. Par la suite, toutes les dimensions spatiales sont considérées au niveau de l'échantillon.

En microscopie électronique à transmission, l'échantillon est une lame mince d'épaisseur t suffisamment faible pour que le nombre d'interactions soit limité et le ralentissement des électrons primaires négligeable. A ce stade, on ne considèrera pour interpréter la formation de l'image que les effets élastiques qui ont pour conséquence d'ouvrir angulairement un faisceau d'électrons incidents initialement parallèle. Le rôle des effets inélastiques et de leurs conséquences sera décrit dans le cours du chapitre VI dédié à la microscopie analytique. Retenons donc pour l'instant que l'effet essentiel imposé par l'interaction électron-matière est de produire à la sortie de l'échantillon un faisceau d'électrons se déplaçant dans différentes directions à l'intérieur d'un cône de diffusion, comme schématisé sur la figure V.3.

Figure V.3 Origine du contraste dit d'absorption introduit par un diaphragme à la sortie de l'échantillon

Supposons que, pour les deux points A et B de l'échantillon qui nous intéressent, on recueille l'ensemble des électrons diffusés. Il n'y aurait pas de contraste. Par conséquent, une première idée simple consiste à introduire dans la colonne après la face de sortie de l'échantillon une ouverture circulaire (un diaphragme de contraste) pour ne sélectionner qu'une fraction seulement des électrons transmis. On conçoit alors que, par cet intermédiaire, il est possible de discriminer deux points sur l'échantillon dont le pouvoir diffuseur (soit la nature des atomes constitutifs, soit le nombre de ces atomes - et par conséquent l'épaisseur locale -) est différent. C'est le principe du contraste d'absorption qui est à la base de la visualisation des structures dans tout spécimen "amorphe". On comprend, à ce stade de la discussion, par amorphe, tout spécimen pour lequel on peut considérer l'échantillon comme un rassemblement dense d'atomes sans organisation particulière, si ce n'est une distance entre plus proches voisins toujours sensiblement équivalent. Pour prendre un exemple concret, il s'agit des échantillons de matière biologique, composés donc essentiellement d'atomes légers C, H, O et N, dans lesquels les structures cellulaires sont rendues visibles par un marquage sélectif avec des atomes lourds (osmium, tungstène, uranium) - voir la figure V.4.

Fig. V.4 Micrographie en fond clair conventionnel d'une section de cellules de rein de poulet infectées par le virus de la Myéloblastose aviaire (leucémie). On distingue parfaitement le noyau (N) avec la chromatine dense et la membrane nucléaire double avec ses pores (p), les polyribosomes (r) attachés aux parois de l'ergatoplasme ou du feuillet cytoplasmique de la membrane nucléaire. Le cytoplasme contient des mitochondries (m) et la coupe transversale d'un centriole (c); on voit quelques microtubules (mt). Dans les espaces intercelullaires sont présents de nombreux virus (v, rétrovirus proche de celui du Sida (cliché E. Delain, IGR Villejuif).

Insistons sur le fait que ce contraste - dit d'absorption - ne correspond pas à une absorption réelle des électrons dans l'échantillon. Pour les épaisseurs usuellement observées, tous les électrons sont transmis. Il s'agit donc d'une "absorption virtuelle" au niveau de l'image, car certains des électrons transmis n'arrivent pas jusqu'au détecteur à cause de l'introduction du diaphragme de contraste.

A ce niveau de la discussion, il est important de revenir sur une propriété essentielle de la lentille objectif, à savoir sa double fonction de produire des images agrandies ou des clichés de diffraction. Reprenons le schéma des trajectoires électroniques à travers une lentille - la discussion qui suit s'applique aussi bien au cas des lentilles de l'optique photonique - voir la figure V.5.

Figure V.5. Double fonction de la lentille objectif pour la formation d'images agrandies ou de clichés de diffraction

 

Le faisceau parallèle à l'axe $A_1 A_o A_2 $ sur l'échantillon est focalisé en un point O au foyer image de la lentille, avant de former une image agrandie et renversée $A'_1 A'_o A'_2$ dans le plan image de la lentille. Mais si dans l'échantillon ce faisceau parallèle est dévié globalement d'un angle tout en restant parallèle, il devient focalisé en un point O' different du point O dans le plan focal, avant de redonner la même image agrandie que le faisceau non dévié par l'échantillon. Cette remarque prend toute son importance car elle montre clairement qu'au niveau de son plan focal une lentille permet de distinguer les trajectoires qui y pénètrent sous des angle q variés. Par exemple, on calcule facilement la distance OO' = f.q dans le plan focal (où f est la distance focale de la lentille). Par conséquent, si on désire filtrer une partie seulement du faiseau transmit dans le microscope électronique à transmission, le diaphragme de contraste doit être introduit dans le plan focale image de la lentille objectif. A ce endroit, il n'interfèe pas avec l'image mais joue pleinement son rôle de filtre de contraste.

Considérons maintenant le cas des échantillons cristallins. Pour des raisons de compacité maximum, les atomes dans un solide ont tendance naturellement à se rassembler en des arrangements bien organisés. C'est identique au pavage d'un sol qui reproduit périodiquement à deux dimensions un même motif de base. De la même façon, la structure stable d'un solide est le cristal qui reproduit périodiquement à trois dimensions le même motif. Depuis longtemps, l'existence de symétries remarquables avait suscité la curiosité des savants qui après Haüy et Bravais au XIXème siècle avaient réalisé un travail énorme de classification suivant le degré de complexité des opérations de symétrie impliquées. La confirmation de l'existence de cet ordre tridimensionnel fut apportée au début du XXème siècle par von Laue à travers ses expériences de diffraction des rayons. Expérience confirmée en 1927 par la diffraction des électrons sur un cristal de nickel réussie par Davisson et Germer qui par la même occasion vérifiaient la dualité onde-corpuscule des électrons. En effet, pour comprendre la diffraction par un réseau, le faisceau primaire doit être décrit comme une onde avec une amplitude, une phase et une longueur d'onde. Il y a diffraction, c'est-à-dire interférences constructives ou destructives dans certaines directions, selon que les ondes réfléchies sur les plans cristallographiques sont, ou non, en phase.

Figure V.6 Diffraction de Bragg sur une famille de plans équidistants.

La figure V.6 illustre un cas particulier, à savoir la diffraction de Bragg par un réseau cristallin. Celui-ci est représenté comme un empilement de plans atomiques séparés par une distance d, qui se comportent vis-à-vis de l'onde incidente comme des plans semi-réfléchissants. Il y a diffraction dans une direction bien déterminée quand les ondes réfléchies sur les plans successifs sont en phase, c'est-à-dire quand la différence de marche entre ces ondes est égale à un nombre entier de fois la longueur d'onde de la radiation incidente, soit d'après la figure :

$$ 2 d \sin q= n \lambda$$

Ceci est la loi de Bragg qui relie la distance interplanaire dans le réseau cristallin à l'angle de diffraction 2q (entre le faiseau incident et le faiseau transmit et la longeur d'onde $\lambda$. Cette formule est valable aussi bien pour un rayonnement électromagnétique que pour celui associé à des particules chargées. Mais on constate immédiatement que pour qu'il y ait diffraction par un réseau cristallin il faut que l soit inférieur à 2d, car sinq est toujours inférieur à 1. Par conséquent pour des distances d de l'ordre de 0,1 à 0,3 nm il en résulte que l doit lui aussi être inférieur à 0,2 à 0,6 nm. Dans le cas du rayonnement lumineux, ceci implique l'utilisation des rayons X (et cet effet a donné naissance à toute la radio-cristallographie). Pour les électrons de haute énergie utilisés en microscopie électronique, pour lesquels la longueur d'onde est environ 100 fois plus faible que la distance entre atomes plus proches voisins, la condition angulaire est respectée sans problème. Les angles typiques de diffraction sur les plans les plus denses d'un réseau cristallin sont alors de quelques 10-2 radians.

Par conséquent, lorsqu'on observe par microscopie électronique un échantillon cristallin, un diagramme de diffraction constitué de spots bien organisés se forme dans le plan focal de l'objectif. Si, par un réglage judicieux de l'excitation des lentilles suivantes de la colonne, on rend ce plan conjugué de celui de l'écran d'observation ou du film photographique, on visualise directement un diagramme de diffraction. Celui-ci renseigne directement sur la structure cristalline (type de symétrie, distances interatomiques) et sur l'orientation de ce réseau ordonné par rapport au faisceau incident.

Figure V.7. Clichés de diffraction réalisés sur un cristal d'alumine Al2O3 orienté suivant l'axe [2110 ]: a) Diffraction conventionnelle en faisceau parallèle ; b) Diffraction en faisceau convergent (clichés D. Bouchet, Orsay)

 

La figure V.7 présente deux exemples de clichés de diffraction ainsi enregistrés. Il est alors particulièrement utile d'identifier l'origine de ces différentes taches en les associant à des familles bien spécifiques de plans dans la structure cristalline, c'est ce qui s'appelle "indexer" un diagramme de diffraction. Rappelons donc que chacun des spots correspond à une direction différente permise aux électrons quittant la face de sortie de l'échantillon, faisant un angle déterminé par rapport à la direction du faisceau incident, prise comme référence (000) dans le centre du cliché de diffraction.

Si on considère à nouveau la figure V.5, il est important à ce niveau de souligner la complémentarité entre les deux plans fondamentaux par rapport à l'échantillon, auxquels la lentille objectif donne accès : le plan image (qui est une image agrandie de l'échantillon, on dit alors qu'elle donne une vision de l'espace réel), le plan diffraction (qui est une carte des directions de diffraction pour une structure donnée, on parle alors d'information liée à une certaine section de l'espace réciproque).

Par un jeu adapté de diaphragmes introduits et déplacés dans ces deux plans, l'expérimentateur dispose d'une grande variété de modes d'observation. Dans une première étape, il choisit au moyen d'un diaphragme de sélection situé dans le plan image une zone bien définie de l'échantillon. En modifiant l'excitation de la lentille intermédiaire, il peut visualiser sur l'écran d'observation le diagramme de diffraction correspondant à cette zone bien définie. Puis au moyen du diaphragme de contraste introduit pour sélectionner ou bien la tache centrale du diagramme correspondant au faisceau transmis, ou bien une tache diffractée, il peut ensuite en revenant dans le mode image visualiser sur l'écran une image dite en champ clair, ou une image dite en champ noir. Cette dernière est donc réalisée uniquement avec les électrons ayant subi une réflexion sur une famille de plans déterminés.

C'est un moyen très puissant pour obtenir une information cristalline très sélective. Dans certains cas (situation à deux ondes), l'échantillon est orienté de façon à ce qu'une seule famille de plans soit en situation pour diffracter. Si, dans le champ observé, un défaut de structure déforme localement le réseau par rapport au réseau parfait, les plans cristallins au voisinage du défaut ne sont pas dans les mêmes conditions de Bragg que la matrice autour. Par conséquent, selon le cas, ces défauts apparaissent en clair sur un fond sombre ou en noir sur fond clair : voir l'exemple présenté dans la figure V.8.

Figure V.8 Images en condition deux ondes (002) de dislocations dans un échantillon de diopside (CaMgSi2O6) déformé expérimentalement à 800°C : a) Image en champ clair réalisée avec le faisceau transmis ; b) Image en champ sombre réalisée avec le faisceau diffracté (002)(clichés J. Ingrin,, Orsay)

De façon générale, pour des orientations de haute symétrie et des échantillons relativement épais le diagramme de diffraction devient très complexe avec de nombreuses taches et des diffusions multiples entre les taches. Néanmoins, même dans ces conditions, les techniques de diffraction sont devenues très puissantes pour étudier la structure cristalline locale. Avec le système d'éclairement on condense le faisceau primaire en un spot de taille réduite sur l'échantillon (l'information acquise est plus localisée) ; dans le diagramme de diffraction, les taches deviennent des disques dont la dimension est déterminée par l'angle de convergence, et la superposition de ces figures de diffraction donne lieu à des diagrammes de diffraction en faisceau convergent, dont l'analyse complexe a ouvert récemment de nouvelles perspectives très puissantes pour l'étude des microstructures cristallines (voir figure V.7b).